关于医学术语

      生殖器疱疹是由单纯疱疹病毒Ⅰ型、Ⅱ型所致性病之一。近年来发病率明显升高。单纯疱疹病毒可引起皮肤、粘膜及多种器官感染。它可以通过性接触感染而发生生殖器官疱疹。
      目前生殖器疱疹的流行情况在STD中非常引人注意，它已成为欧美最常见的性病之一。如英国自1971年的4000例增至19８5年的20000例。在美国，1966-1984年已增加了15倍。估计美国人群累计病例超过3000万。本病占STD中第5位（7.7%）。在欧美国家中占5%-10%，特别是最近由于性行为多样化，口腔性行为的普遍，生殖器从口腔感染HSV相对增多。另外还有一个背景，即对HSV无免疫，故成人感染增加。HSV-2是生殖器疱疹的主要病原体，90%生殖器疱疹病例是由HSV-2型引起，10%由HSV-1型引起。世界各地HSV-2型患病率显著增加，临床所见的生殖器疱疹患者中，年龄最小者16岁（女），最大者为69岁（男），无论男或女均以20-30岁年龄组，发病率最高，其比率分别是38%（男）和52%（女）。在美国大学生中，HSV-2血清流行率仅2%-4%，而家庭诊所就诊者则高达25%~30%。在美国总人口中近10年HSV-2血清流行率增加了1/3，达23%。在发展中国家，HSV-2血清流行率更高，如乌干达妇女保健诊所高达41%，秘鲁STD中心为83%。在我国近几年生殖器疱疹也明显增加。但发病率没有详细统计。
      人群中HSV感染较为普遍，人是疱疹病毒的自然宿主。主要传染源是生殖器疱疹患者和无症状的病毒携带者。追查男性的传染源，近半数归咎于嫖妓，其他几乎来自各种类型的不洁性行为的性滥者。生殖器疱疹患者是在与性伴的性接触中感染上本病的，而这些性伴通常不知道自己已患上了生殖器疱疹。这就是生殖器疱疹广泛蔓延的原因之一。
      HSV-1常由飞沫和唾液传播，而HSV-2几乎都是性接触传播
      HSV感染的诊断要依据病史、临床表现和实验室检查结果而定。有不洁性交史，而且在生殖器部位出现皮肤红斑和原发性水疱，易复发等不难诊断。必要时可作疱液涂片，培养、接种、免疫荧光检查。血清免疫抗体测定等，均有助于诊断和确定病毒类型。
      一、细胞学方法
      对皮损刮片做Wright-Gemsa（Tzanck试验）或Papanicolaou染色，可检出HSV感染特征的巨细胞包函体，但不能区别HSV感染或水痘-带状疱疹病毒感染，敏感性仅为病毒分离的60%。
      二、培养法
      从水疱底部取材做组织培养分离病毒，为目前较敏感、最特异的检查方法，需5-10天，因其技术条件要求高，价格昂贵，不能普遍使用。
      三、抗体检测
      目前最广泛的是HSV-2抗体检测，如蛋白印迹法也可用gD2作抗原检测HSV-2抗体，具有敏感性，且能区分HSV-1和HSV-2的优点。
      四、基因诊断
      （一）用PCR分型检测单纯疱疹病毒
      PCR是一种敏感性高，特异性强的快速检测方法，标本中含有1fgHSV-DNA就可以检出，其在HSV感染的诊断研究中发展较快，且分型检测HSV是发展的趋势。
      1、标本采集和处理
      （1）标本采集
      ①脑脊液：直接无菌采取患者0.5ml脑脊液标本于无菌试管送检.如肉眼可见血色,应离心取上清。
      ②羊水及婴儿血清：同上,应避免溶血.
      ③脑组织：脑组织尸检、活检标本,加1mlPBS标本缓冲液研磨后，待检。
      ④眼及皮肤病灶分泌物：用预测（半干）棉拭子直接取患处分泌物，置1mlPBS标本缓冲液中送检。
      ⑤生殖器（宫颈、阴道、外阴、阴茎）标本：先用消毒棉拭子擦去病变部位表面粘液、污垢，再用预潮棉拭子用力擦拭患处分泌物，置1mlPBS标本缓冲液中送检。
      （2）标本处理
      ①预处理：所有液体标本均可直接进行模板制备;可以取100μl标本液，离心5000r/min×5min后，去上清，取沉淀物进行模板制备。
      ②模板制备：a：蛋白酶K消化裂解法：沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，55℃1h后，煮沸10min，离心5000r/min×5min，收集上清。b：水煮法：沉淀物加100μl蒸馏水，摇均水煮20min，离心5000r/min×5min收集上清。c：1%TritonX-100裂解法：取采集的标本液100μl，加入1μlTritonX-100，水煮20min，5000r/min×5min，收集上清。d：5%NP-40裂解法：取采集的标本液100μl，加5μlNP-40，水煮20min，5000r/min×5min收集上清。e：如标本溶血严重经上述裂解处理后，再加等体积酚-氯仿抽提、冷乙醇沉淀DNA，加10μlDW溶解待检。
      2、PCR扩增
      （1）引物设计。以HSVDNA聚合酶的高保守区为检测靶序列以确保特异性。设计3个引物，一个上游共同性引物，DNAP5（5′ATGGTGAAAACATCGACATGTACGG3′）：二个下游特异性引物，DNAP3-1（5′CCTCGCGTTCGTCCTCGTCCTCC3′）和DNAP3-2（5′CCTCCTTGTCGAGGCCCCGAAAC3′），可以分别扩增出HSV-1469bpDNA片段（1981～2359）、HSV-2391bp片段（1561～1953）：从二型PCR扩增产物中设计了一个不分型的特异性探针HSVP35GGCGTAGTAGGCGGGGATGTCGCG3）。
      （2）PCR实验体系。取模板10μl：DNAP50.5（0.2μmol/L）：DNAP3-10.5μl(0.2μmol/L)：DNAP3-20.5μl(0.2μmol/L)：4×dNTP8μl(4×200μmol/L)：10×dNTP8μl(4×200μmol/L);10×缓冲液10μl：DMSO4μl;加DW65.5μl;石蜡油30μl.。
      水煮（96℃～100℃）7min
      加TaqDNA聚合酶1μl;（2.5U）
      72℃4min
      ↓
      95℃40s
      ↓
      65℃60s→72℃70s
      ↓33个循环
      70℃4min
      3．扩增产物的检测和分析
      （1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取扩增产物20μl加样品缓冲液4μl混匀后，点样于2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15～20min，溴化乙锭（EB）染色5min，于紫外灯下观察结果在溴酚蓝后面有一条或二条亮红带为阳性结果，HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。
      （2）XhoI酶谱法：取HSV-1型PCR产物50μl加XhoI50U，37℃1h后，置3%琼脂糖凝胶中，70V电泳15～20min，可产生46bp片段带（引物后面）;与正常PCR产物比较，XhoI酶切后的大片段电泳位置前移。
      （3）Southern印迹法：PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上：80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32p标记HSVP3探针后,42℃杂交过夜;次日用1%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2,42℃洗15min;膜置X线暗盒内放射性自显影12～15h,显影为阳性,不显影为阴性。
      （二）套式PCR
      套式PCR（nestedprimers-polymerasechainreaction，NP-PCR）是通过“外侧”、“内侧”两对引物，即一对扩增较大DNA片段的“外侧”引物和一对位于扩增产物中再扩增小片段的“内侧”引物，这样两次连续放大可以提高PCR检测的灵敏度，保证产物的特异性。但该方法不能分型，能100%检出HSV-1，50%检出HSV-2，应改进分型检测HSV，更好地在临床应用和基础研究中推广应用。
      1、标本处理：
      （1）标本采集同上
      （2）DNA制备：①脑脊液：取100μlCSF水煮15min,加入250μl无水乙醇，放-30℃10min;离心10000g30min，去上清，30℃干燥后，加入10μlDW;②脑组织细胞：取沉淀物加100μl蛋白酶K消化裂解液，56℃作用1h，水煮10min;取上清加入等体积酚一氯仿（V/V），轻摇10min，离心10000r/min×10min;取水相，加入250μlDW溶解。
      2、PCR扩增
      (1)引物设计：选择HSV1糖蛋白D基因为检测靶基因。
      (2)PCR实验体系和程序：反应体积为50μl;模板10μl;BJHSV1.10.5μl(0.2pmol/L);BJHSV1.20.5μl(0.2pmol/L);10×缓冲液5μl;4×dNTP4μl(4×200mmol/L);DW27μl;石蜡油30μl。循环参数为95℃30s;55℃30s;72℃60s;循环20次,取其扩增产物1μl加入含有BJHSV1.3和BJHSV1.4反应体系中进行套式扩增,先95℃变性2min，循环参数为95℃30s;55℃30s;72℃60s;循环30次后，72℃延伸5min;。
      (3)扩增产物分析：
      ①琼脂糖凝胶电泳染色法：
      取扩增产物10μl点样于2%琼脂糖凝胶中，70V电泳15-20min,溴化乙锭染色5min，于紫外灯下观察结果,在溴酚兰后面有一条，或二条亮红条带为阳性结果,HSV-2带在前，HSV-1带在后，无带则为阴性结果。
      ②Southern印迹法：
      PCR产物20μl经电泳分离后，用变性液处理60min，再用中和液处理90min，转移至硝酸纤维素膜上，80℃烤膜2h，42℃预杂交（杂交液中）30min，加入32P标记HSV探针后，42℃杂交过夜，次日用1%SDS/PBSpH7。2，42℃洗15min，0.5%SDS/PBSpH7.2，42℃洗15min;膜置X线暗盒内，放射性自显影12-15h，，显影为阳性，不显影为阴性。
      （三）、聚合酶链反应-酶谱法（polymerasechainreaction-endonucleasecleavagePCR-EC）
      具有经济广泛等特点;不仅能一次性分型检测HSV-1，HSV-2，EBV，CMV四种病毒，而且方法本身快速、方便、无放射线损伤，易被实验室接受。可检出3个CFU的HSV1，灵敏度高，能检测出中枢神经系统感染第1dCSF中HSVDNA阳性结果，并可用于药物治疗效果的评价。由于病毒的变异性，会出现酶切点突变丢失现象，从而造成酶切阴性结果。对此可以通过型特异性探针或序列分析解决。
      1.标本处理
      （1）标本采集，方法同上。
      （2）DNA模板制备：每份标本取200μl，按200μg/ml加入蛋白酶k，56℃作用1h;
      加入等体积的酚-氯仿（v/v）轻摇10min，离心1000r/min×5min;取水相加入500μl(2.5倍体积)无水乙醇，-20℃过夜沉淀DNA，离心15000r/min×5min,吸去液体，30℃干燥后,加蒸馏水25μl溶解,待检。
      2.引物设计：
      P1，5′CGACTTTGCCAGCCTGTACC3′
      P2，5′AGTCCGTGTCCCCGTAGATG3′
      （1）PCR实验体系：
      反应体积100μl;模板10μl;P10.5μl(10pmol/L)，P20.5μl(10pmol/L);4×dNTP4μl(4×200mmol/L);10×缓冲液10μl,DMSD5μl,DW65μl,循环参数为94℃60s;60℃60s;72℃60s;循环40次72℃延伸4min。
      （2）扩增产物检测与酶切分型.
      ①第一步电泳鉴定：取10μlPCR产物加4μl样品缓冲液,加入2%琼脂糖凝胶板,70V电泳(5-20min)加EB染色5min后,紫外灯下观察,可初步鉴定扩增产物大小。
      ②酶切分析：分别取20μlPCR产物于2个Eppendf管中，加入50μl无水乙醇，-20℃沉淀DNA，再分别用20μlSmal和BamHI反应缓冲液溶解，加入SmaI或BamHI50U于相应Eppendf管内，37℃作用1h。
      ③第二步电泳分型，取10μlPCR酶切物加4μl样品缓冲液，加到2%琼脂糖凝胶中,70V电泳,15-20min后,EB染色5min,与同步加入未酶切的PCR产物相对照。
      （四）用RT-PCR检测单纯疱疹病毒
      RNA的聚合酶链反应（RNA-PCR），可能通过检测HSV不同期的RNA，这不仅可诊断HSV感染，而且有利于HSV的潜伏期感染机制的深入研究。
      RT-PCR是以RNA为模板经逆转录反应（RT）产生cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增以达到检测目的。因此，RNA-PCR也可称为RT-PCR。
      1、标本处理：
      组织块细胞总RNA提取，取100mg组织标本，加1ml硫氰酸胍变性液，于匀浆器中，室温研磨均匀后，移入2.5mlEppendf管中。依次加入0.1ml3mol/L(pH4.0)NaAc,1ml水饱和酚和0.2ml氯仿一异戊醇混匀,用力振摇10s,置冰浴15min。10000g4℃,离心20min,取上清水相(上层DNA、下层DNA和变性蛋白质)加入等体积异丙醇置-20℃1h,沉淀RNA。离心15000r/min×10min,弃上清,RNA重新用0.3ml硫氰酸胍变性液溶解,再加0.3ml异丙醇沉淀,-20℃1h,沉淀RNA.离心15000r/min×10min,去上清,沉淀RNA用75%冷乙醇洗一次,真空干燥。.加10μlTE缓冲液（pH7.4）溶解,低温保存备用.临用前冰浴溶解。
      2、PCR扩增：
      （1）引物设计：选择HSV-1ICPO基因(极早期)为检测靶基因.设计2个引物，
      P15′GGATCCTCACGTGGTTACCCGCGGTCT3′
      P25′AAGCTTCCGGGGCCGTCCCCGCGGGCG3′可以扩增ICPO中266bp序列。
      1个探针：5′CCGGCTGGAGCCGCCGCACCCTGCT3′。
      （2）PCR实验体系：总反应体积为50μl，模板10μl（0.25-1.0μg）P11μl(20pmol/L);P21μl(20pmol/L);4×dNTP4μl（200μmol/L);10×缓冲液5μl;AMV(逆转录酶)2μl(50U);DW26μl;循环参数,94℃变性2min后94℃50s，60℃60,72℃60s，循环40次后72℃延伸5min。
      3、扩增产物的鉴定：
      （1）琼脂糖凝胶电泳染色法：取10μlPCR扩增产物加4μl样品缓冲液，混匀后加样2%琼脂糖凝胶板，70V电泳15-20min，EB染色5min。紫外灯下观察扩增条带。
      （2）Southern印迹杂交法：用32P标记的特异性探针检测PCR产物，方法同上。
      总之，在HSV感染性疾病的临床诊断中，PCR能对前病毒或潜伏期低复制的HSV特异性靶DNA片段进行扩增检测，远较DNA探针敏感，并能在血清中抗体出现前就可以检出。因此，PCR无论是作为基础研究手段，还是作为临床检验诊断方法，均具有广阔的前景。
      五、病理组织学诊断
      细胞内水肿，基底层形成大水疱，病灶周围有多核巨细胞浸润，特别是多核白细胞与淋巴细胞充斥于病灶中间。